METODY

---- Planktonní sítě ---- In progress...

Nejčastěji a nejsnáze lze drobné vznášející se tvory sbírat s pomocí planktonních sítí. To jsou síťky kuželovitého tvaru, na jejichž koncích může být výpusť (např. kohoutek). Jako výplňová tkanina se dříve u planktonek používalo mlynářské hedvábí, které však ztrácelo po delší době používání předem daný průměr oček (postupně se sráželo). V současnosti jsou více v oblibě umělé tkaniny, jakým je kupříkladu pevný uhelon. 

Odebírá se různými způsoby, buď vertikálním tahem vodním sloupcem, což se nám obvykle podaří z loďky či mola, nebo táhnutím planktonky po diagonále mezi dnem a hladinou. V místech, kde by se mohla síťka poškodit (mezi rostlinami apod.) jsme nicméně nuceni vodu sbírat do nádoby upevněné k teleskopické tyči. Její obsah se poté cedí normálně přes planktonku. 

Protože lovíme plankton, který dosahuje různých velikostí, volíme si předem takovou síťku (resp. velikost ok), se kterou budeme schopni sbírat naši cílovou skupinu. Jde-li hlavně o planktonní živočichy, snažíme se zaměřit na oka v rozsahu 40 až 80 mikronů. Pro amatérský lov postačí bohatě síťka s 80 μm. Kdežto fytoplankton (a také většinu nálevníků) filtrujeme planktonní sítí s 10μm a menším průměrem ok.

Jestliže chceme získat vzorky, které nám nezkreslují skutečné množství planktonu ve vodním sloupci, je nutné hledat mnohem profesionálnější nástroje k odlovu. Při odběrech si musíme uvědomit, že velké perloočky a klanonožci jsou schopni se před síťkou uhýbat. Úspěšnost lovu se odráží také od rychlosti, se kterou síˇtku táhneme. Čím rychleji budeme vléci, tím více vody se bude před planktonkou hrnout. Navíc se se sítěmi s menšími očky výrazně hůře manipuluje a méně efektivně loví. Téměř reprezentativní vzorek bychom mohli dostat použitím Apsteinovy sítě. Na ni se nasazuje plechový nástavec, který právě brání nadbytečným turbulencím před ústím při vlečení a zvyšuje filtrační plochu. 

Zpracování vzorků, fixace, konzervace 

Jakmile máme nachytaný plankton v nádobkách, je vhodné v případě zachování živého vzorku obsah ještě naředit – snažíme se, aby byla odběrná láhev naplněna zhruba do 2/3 z důvodu zachování vzduchové kapsy nad hladinou. Vzorky se živými objekty se snažíme vždy přesunout do chladu a šera (nejlépe transportní ledničky). Mimo terénní prostředí materiál přemístíme do lednice o 4 °C, kde jej lze držet až 3 dny od provedených odběrů.

Před fixací odebraného materiálu vzorky částečně prohlédneme pod mikroskopem a binokulární lupou. Rychlé jedince je možné před usmrcením při pozorování ještě narkotizovat, tak abychom zcela omezili jejich pohyb. K tomu nám postačí pro studium živočichů ethylester kyseliny octové či nasycená voda oxidem uhličitým nebo malé množství rozpuštěné modré skalice (existuje však nepřeberně více možností). Nálevníky v pohybu zpomalíme přikápnutím methylcelulózy v poměru 1:1 ke kapce na sklíčku. 

V zásadě využíváme několik chemických činidel pro fixaci a následnou konzervaci těl (buněk). K základním patří formalín o koncetraci 4 % (na fytoplankton, vířníky a korýše), nejméně 70% ethanol (zooplankton) či ředěný Lugolův roztok (řasy a vířníci). Materiál se zooplanktonem scedíme na koncentrát obsahující jenom tělíčka korýšů, většiny vířníků a některých dalších větších organismů pomocí sítka s oky o průměru 70 μm. Biomasu na sítku jemně opláchneme střičkou s destilovanou vodou a následně střičkou s alkoholem spláchneme do skleněných vzorkovnic. Pro zpevnění krunýře méně chitinizovaných perlooček je dobré do sklenic s fixovaným materiálem přikápnout malý podíl glycerolu. Lugolův roztok jako fixační médium ředíme na výslednou koncentraci přibližně 6 %. Všechny zakonzervované vzorky musíme uchovávat nadále v lednici. 

Příprava preparátů k základnímu prohlížení a focení

Zakonzervovaný nebo živý vzorek převedeme na plošku, která poskytne optimální prostor k jeho prohlédnutí. Existuje hned několik možností, pokud se uchýlíme k užití standardních optických přístrojů. Rozměrnější objekty lze nejlépe a dostupně zkoumat s binokulární lupou, která poskytuje ucelený obrázek o celkovém tvaru i barvě (při horním násvitu) pozorovaného předmětu. Ta umožňuje snadné manipulace se vzorky formou preparací, jimž se při determinaci často nevyhneme. U mě našla binolupa uplatnění ponejvíc při zásazích, jako jsou obvykle přesuny požadovaného subjektu při třídění podle konkrétně zvoleného kritéria (velikost, infekce). Nejdokonalejší binolupy mohou v některých situacích plně nahradit složitější mikroskopy, dokud se velikost konkrétního objektu pohybuje ještě v rozmezí nebo nevzdáleně pod hranicí rozlišovací schopností lidského oka. Jsou tak užitečnými nástroji nejen pro zběžný náhled mezi nasbíraný materiál, ale rovněž solidními prostředky pro určování velké řady drobných zástupců. Mnoho obdobných úkonů lze provést s inverzními mikroskopy, které též neobrací projektovaný (skutečný) obraz, čímž se se zobrazovanými objekty manévruje pohodlněji. Navíc u obou voleb ani přiložený vysokostěnný plastik (kultivační zkumavky a destičky), tak Petriho misky nikterak nezaclání kompletně osazenému karuselu. 

Proces převodu vzorků na podložní skla bývá předmětově specifický. Vždy nestačí kapku s objektem jenom slepě přikrýt tenkým krycím sklem – postačí to jistě při vlastním prohlížení ve vodě rozptýlených částic (např. řas). Jako limitující faktor vystupuje vyčnívanost objektu a s ní provázaná náchylnost k zatížení. Právě ke snížení komprese vysokých objektů (např. dafnií) a vyhnutí se jejich úplnému smáčknutí, krycí sklo podkládám – vymodelovanými kuličkami na míru z tvarovatelného vosku či plastelíny. Pro rutinní zpracování vzorků poslouží speciální podložní sklo s proláklinou (ev. výbrusem) jako komůrkou (viz Segwick-Rafterova komůrka) s normovaným objemem – ustálil jsem se na 300 a 500 µl komůrkách, které příliš nerozkládají kvalitu obrazu a mocnost jejich stěn poskytuje schůdnou pracovní vzdálenost pro silně přibližující objektivy, u nichž se tato hodnota pohybuje v rozpětí 150 až 900 mikrometrů. 

Odlišně přistupuji ke sklu, který figuruje jako podklad pro fotografované objekty. Určitou nesnáz představují reziduální prachové částice, a vůbec jakékoli znečistění povrchu, které během standardní práce nemusí být třebas povšimnutelné. Poněvadž se řada snímku neobejde bez postupného skládání jednotlivě proložených (zaostřených) rovin v tzv. Focus-stack sowfwaru (př. Helicon Focus) a to z prostorových důvodů i nízké hloubky ostrosti silnějších objektivů, precizní očištění pracovní plochy skla se stává nezbytné. Špína se při postupném rastrováním fotek zdánlivě přemísťuje (spiralizuje se apod.) vlivem nezávadné a nevyhnutelné diskrepance paprsků zdrojové lampy, čímž se výsledný snímek leckdy znehodnotí. Abyste se kontaminantům co nejvíce vyvarovali, skla minimálně omyjte v tekutém detergentu. Vhodnou a časově nenáročnou údržbu představují thioderiváty alkoholů napuštěné čisticí hadříky (ubrousky). V krajním stavu se lze spokojit se snadno komerčně dostupným lihem, vězte ovšem, že koncentrovaný ethanol zanechává i přes řádné rozleštění nevýrazné šmouhy – nadto po nasvícení UV světlem se sklo zobrazí mléčně zmatnělé, čímž se tok světla změkčuje, což se marginálně podepíše na zřetelnosti obrazu v rámci fluorescenčních technik. 

Leč zdlouhavější třífázový postup, avšak výsledně s minimálními povrchovými zůstatky, reprezentuje promýtí a cídění v pořadí kyseliny octové (8 %), přípravku Hellmanex a pentanu (ev. hexanu). První 2 chemikálie ponechávám v 50ml falkonách, do nichž lze zasunout většinu běžných podložních skel – ta postačí louhovat v obou substancích zvlášť 5 minut. Nutně skla před převedením do prostředku Hellmanex důkladně omývám proudem vody (střičkou), stejně též po vyjmutí ze zkumavky Hellmanex. Pentan jako nepolární činidlo rozpustí případnou mastnotu, ale zejména slouží k modulaci smáčivosti vnějšku skla, když předmět vyžaduje vzhledem k náchylnosti k tenzi zmiňované podsazení krycí skla. Snazší smáčivost jinak znesnadňuje tvorbu ucelené (nerozbíhající se) kapky, do níž se daný objekt zanoří. Naopak s tenoučkým hydrofobním biofilmem jsem schopen pipetou aplikovat kapku stejného objemu, ale vypouklou, která se nakonec snadno spojí a přimkne ke krycímu sklu, aniž by došlo k deformaci pozorovaného objektu.  

Zdroje a užitečná literatura: 

Duras, J., Potužák, J. (2016): Je vůbec možné, aby byla v rybnících čistá voda? Fórum ochrany přírody 3: 33–37. Dostupné z: https://www.casopis.forumochranyprirody.cz/uploaded/magazine/pdf/9-je-vubec-mozne-aby-byla-v-rybnicich-cista-voda.pdf

Juračka, J. P. (2020): Chobotnice z Londýna. Vesmír 99(1): 46–47. Dostupné z: https://vesmir.cz/cz/casopis/archiv-casopisu/2020/cislo-1/chobotnice-z-londyna.html

Přikryl, I. (2006): Metodika odběru a zpracování vzorků zooplanktonu stojatých vod. VÚV TGM, Praha. Dostupné z: https://www.mzp.cz/C1257458002F0DC7/cz/prehled_akceptovanych_metodik_vod/$FILE/OOV-stojate_zooplankton-20061001.pdf

Kořínek V. (2005): Dichotomický klíč perlooček (Cladocera) České republiky (nepublikováno).

Komárková, J. (2006): Metodika odběru a zpracování vzorků fytoplanktonu stojatých vod. VÚV TGM, Praha. Dostupné z: https://heis.vuv.cz/data/webmap/datovesady/projekty/ramcovasmernicevoda/docpublikace/OOV-Stojate_fytoplankton-20061001.pdf

Schubert A. (1973): Život ve sladkých vodách. Státní pedagogické nakladatelství. Praha. 

Klíče, které používám k určování zooplanktonu:

L. A. Bledzki and J. I. Rybak, Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, 2016 ed. Německo: Springer, 2016

Přikryl, I. (2000): Klíče středoevropských Cyclopidae

Přikryl, I. (2018): Klíč Calanoida Čr a okolí

Amoros, C. (1984): Crustacés cladocéres. Bulletin mensuel de la Sociéte Linnéenne de Lyon, 53: 3,4. 

Illyová, M., Baláži, P., Hydrobiologický determinační atlas: Konzumenty IV. Vírniky - Rotifera

Kořínek, V. (2005): Dichotomický klíč perlooček (Cladocera) České republiky

Koste, W. (1978): Rotatoria. Die Rädertiere Mitteleuropas. Ein Bestimmungswerk, begründet von Max Voigt. Überordnung Monogononta. Německo: Gebrüder Borntraeger

Bartoš, E., Fauna ČSR. Vířníci - Rotatoria. Praha: ČSAV, 1959

Smirnov, N. N., Fauna of the U.S.S.R. Crustacea Vol. I, No. 2: Chydoridae. Rusko: Nauka, 1971

Smirnov, N. N., Cladocera: the Chydorinae and Sayciinae (Chydoriadae) of the World. Nizozemsko: SPB Academic Publishing bv, 1996

Bick, H., Ciliated protozoa: an illustrated guide to the species used as biological indicators in freshwater biology. Švýcarsko: World health organization, 1972

Patterson, D. J., Freeliving Freshwater Protozoa: A colour guide. Anglie: Manson publishing Ltd, 1996

Klíče, které používám k určování fytoplanktonu:

Kaštovský, J., Hauer, T., Geriš, R., Chattová, B., Juráň, J., Lepšová-Skácelová, O., Pitelková, P., Pusztai, M., Škaloud, P., Šťastný, J., Čapková, K., Bohunická, M. & Mühlsteinová, R. (2018): Atlas sinic a řas ČR. powerprint, Praha.